从实验设计到扫描，多重荧光免疫组化结果不佳的原因|威奥生物帮你一网打尽！
发布时间：2025-10-09 10:38 | 点击次数：193
多重荧光免疫组化（mIHC/TSA）技术难度高，结果不佳往往是由多个因素共同导致的。
下面是上海威奥生物为您整理的系统排查清单，从实验设计到最终扫描，帮助您分析结果不好的原因。
（一）、抗体选择不当：
物种交叉反应：一抗来源于相同或相近的物种（如大量使用兔源一抗），导致二抗交叉结合，产生假阳性。
抗体未经验证：抗体未在多重荧光实验中被验证，可能特异性差或有非特异性结合。务必查阅文献或厂家说明书，确认抗体适用于多色IHC/IF。
抗体组合不兼容：选择的抗体其染色模式（膜/核/质）重叠，或信号强度差异过大（一个极强，一个极弱），导致弱信号被掩盖。
（二）、panel设计不合理：
荧光染料光谱严重重叠：选择的荧光染料（如FITC和Alexa Fluor 488）其激发/发射光谱重叠度高，导致通道间串色（Crosstalk/Bleed-through）。
染料与蛋白表达量不匹配：将最亮的染料分配给了表达量最低的目标蛋白，反之亦然，导致信号无法有效检测或过曝。
（一）、样本质量问题：
组织固定不当：固定不及时或固定时间过长/过短，导致抗原掩蔽或降解，影响抗体结合。
组织切片过厚：>5μm的切片可能导致荧光信号重叠，层次不清，影响后续分析。
（二）、抗原修复失败：
修复方法选择错误：某些抗原需要热修复（HIER），而另一些需要酶修复（ER）。方法错误会导致抗原表位无法暴露。
修复条件不充分：修复液的pH值、温度、时间不足，未能充分逆转甲醛交联造成的抗原掩蔽。
（一）、非特异性结合与背景过高：
封闭不充分：使用血清或BSSA封闭时间不够，或封闭剂不能有效封闭非特异性位点，导致背景高。
抗体浓度过高：一抗或二抗浓度过高是导致背景过高、信噪比下降的最常见原因。
清洗不彻底：步骤间洗涤不充分，未能洗去未结合的抗体，导致非特异性残留。
（二）、抗体间相互干扰：
实验流程设计错误：直接混合所有一抗或二抗进行孵育，可能导致抗体间相互结合和干扰。推荐采用顺序染色（Sequential Staining）：即完成第一个靶点的“一抗-二抗”孵育和信号检测后，再进行下一个靶点的染色。
种属来源冲突：参见第一点。
（三）、荧光淬灭：
操作未避光：从二抗孵育开始，所有步骤都应在避光条件下进行，否则荧光染料会迅速淬灭，信号减弱。
封片剂不含抗淬灭剂：使用的封片剂必须含有抗荧光淬灭成分（如DAPI），否则信号衰减很快。
（一）、图像采集问题：
通道串色（Crosstalk）：未进行单染样本对照来校准相机的通道设置，导致一个通道的信号“泄漏”到另一个通道。
曝光时间设置不当：曝光过度导致信号饱和，细节丢失；曝光不足导致弱信号无法检测。
激光功率过高：导致荧光淬灭和样本损伤。
（二）、数据分析问题：
共定位分析错误：误将两个相邻但独立的信号判为共定位。真正的共定位需要高精度的显微镜和专业的分析软件（如APTime）进行定量分析。
背景扣除不当：图像分析时未正确设定阈值，将背景噪音误判为阳性信号，或忽略了弱阳性信号。
上海威奥生物组织芯片多重荧光免疫组化（mIHC）实验服务是一种高效、高通量的技术，可同时检测同一组织样本中多种靶标蛋白的表达和空间分布，广泛应用于肿瘤微环境、免疫细胞浸润、药物靶点验证等研究。
1.实验设计
靶标选择：通常支持4-7种蛋白标记（如PD-L1、CD8、CK、FOXP3等），需避免抗体种属交叉反应。
组织芯片制备：客户提供石蜡样本（FFPE）或可委托我司制作，包含数十至数百个组织点。
抗体优化：验证抗体特异性、稀释比例及荧光染料搭配（如Opal、Cy系列、Alexa Fluor）。
2. 实验步骤
样本准备（石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片或者细胞涂片）→ 抗原修复 → 阻断内源性过氧化物酶→非特异性靶点封闭→加一抗→加HRP 多聚物二抗→TSA荧光染料反应液反应→抗体洗脱→DAPI复染细胞核→封片→镜检拍照（切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观 察并采集图像。）
3. 数据分析
面积定量模块→目标物定量模块→明场细胞分析模块→荧光场细胞分析模块→特殊结构识别模块→TMA分析模块→空间分析模块（浸润分析、最近分析、临近分析、Hub 分布、聚集体分析、细胞分型展示、定量热图展示）
高通量：单次实验可分析数十至数百个样本。
空间信息保留：揭示蛋白在组织微环境中的共表达及相互关系。
高灵敏度：TSA信号放大技术可检测低丰度靶标。
肿瘤免疫：评估PD-1/PD-L1、CD4+/CD8+ T细胞空间分布。
神经科学：神经标记物共定位（如GFAP、NeuN）。
转化医学：生物标志物筛选或药物疗效预测。
- 优先选择提供从实验到分析的一站式服务供应商。是否可提供资质证明等相关文件等。
- 确认是否具备组织芯片制备能力，是否支持定制化制备（以便于后续实验开展，如细胞邻域分析、空间转录组关联）。
-要求提供标准化报告模板（如热图、空间分布图、统计表）。
上海威奥生物科技有限公司，成立于2008年8月，坐落于上海市闵行区江月路999号9幢4层（奇亚特中心），交通便利，环境优美，欢迎来公司考察、洽谈！
经上海市有关部门批准，公司建立了近1500㎡的GMP标准化生产车间、研发中心、标准化的实验服务检测中心，是为数不多的既有研发生产中心，又有实验检测中心的高科技生物公司。
公司有生产资质；生产车间可参观，产品可OEM。
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