ELISA实验总翻车？深度剖析失败原因，威奥生物助你搞定数据，轻松发表Cell期刊

  上海威奥生物生产的ELISA试剂盒采用“夹心法”，将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的靶蛋白，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合， SABC复合物与生物素化检测抗体结合，形成免疫复合物，加入TMB显色液后，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加入终止液变黄色，检测过程中未结合的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，靶蛋白浓度与OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度，从而对检测样品进行定性或相对定量分析。

1. 加样：空白孔加入 50μl 标准品/样品稀释液，其余孔各对应加入标准品或待测样品 50μl，贴上封板胶纸，将反应板混匀后置 37℃，50 分钟。

标准品配制：取8个1.5ml离心管，分别标注S1,S2,S3,S4,S5,S6，S7,Blank,第一管S1中加入标准品/样品稀释液900μl，S2至Blank中分别加入标准品/样品稀释液200μl，在第一管S1中加入标准品S（10×）溶液100μl置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200μl，移至S2，如此反复作对倍稀释至S7,混匀，Blank为空白对照。（标准品的用量也可根据自己需要配置）

2. 洗板：用 1×洗涤液将反应板充分洗涤3次，每孔加入 1×洗液 300μl，每次震荡/浸泡 1-2 分钟，向滤纸上印干。

洗涤液配置：用蒸馏水1:30稀释（例：1ml 浓缩洗涤液加入 29ml 的蒸馏水）。

3. 加抗体：空白孔加入 100μl 生物素化抗体稀释液，其余孔各加入 1×的生物素化抗体工作液100μl，贴上封板胶纸，混匀后置 37℃，50 分钟。

生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将 100×生物素化抗体稀释成 1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。

4. 洗板：同上。

5. 加SABC：每孔加入 SABC 复合物工作液 100μl，贴上封板胶纸，混匀后置 37℃，30 分钟。

SABC复合物工作液配置:使用前20分钟，用SABC复合物稀释液将100×浓缩SABC复合物稀释成1×工作液，当日使用，剩余弃之。

6. 洗板：同上。

7. 加显色液：每孔加入提前配置好的 TMB 混合液100μl，混匀后贴上封板胶纸，置于37℃暗处反应10-20分钟（具体显色时间根据显色结果而定）。

TMB 显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液 A 液和 B 液 1：1 混合，避光放置备用。

8.加终止液：每孔加入50μl终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

小提示：

1.如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。
2.当标准品/样品稀释液及洗涤液不够用时，可以用 1*PBST 替代。

检测前试剂准备

1. 所有OD值建议减除空白孔值后再进行计算，如空白孔OD低于0.1，也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品OD 值计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。